Vielen Dank für Ihren Besuch auf nature.com.Sie verwenden eine Browserversion mit eingeschränkter CSS-Unterstützung.Um die beste Erfahrung zu erzielen, empfehlen wir Ihnen, einen aktuelleren Browser zu verwenden (oder den Kompatibilitätsmodus im Internet Explorer zu deaktivieren).In der Zwischenzeit zeigen wir die Website ohne Stile und JavaScript an, um eine kontinuierliche Unterstützung zu gewährleisten.npj Microgravity Volume 8, Artikelnummer: 17 (2022 ) Diesen Artikel zitierenLangfristige Weltraummissionen haben eine erhöhte Inzidenz von Munderkrankungen bei Astronauten gezeigt und sind daher eine der wichtigsten Erkrankungen, die sich voraussichtlich auf zukünftige Missionen auswirken werden.Hier haben wir uns vorgenommen, die adaptive Reaktion von Streptococcus mutans (ätiologischer Erreger von Zahnkaries) auf simulierte Mikrogravitation zu bewerten.Dieser Organismus wurde auf der Erde gut untersucht und Behandlungsstrategien sind vorhersehbarer.Trotzdem sind wir unsicher, wie das Bakterium auf die Umweltstressoren im Weltraum reagieren wird.Wir verwendeten experimentelle Evolution für 100 Tage in Gefäßen mit hohem Seitenverhältnis, gefolgt von einer Resequenzierung des gesamten Genoms, um diese adaptive Reaktion zu bewerten.Unsere Daten zeigen, dass planktonische S. mutans Varianten in drei Genen (pknB, SMU_399 und SMU_1307c) entwickelt haben, die eindeutig simulierten Mikrogravitationspopulationen zugeordnet werden können.Darüber hinaus zeigte die Sammlung von Daten zu mehreren Zeitpunkten Mutationen in drei zusätzlichen Genen (SMU_399, ptsH und rex), die in simulierten Mikrogravitationspopulationen früher entdeckt wurden als in den normalen Schwerkraftkontrollen, von denen viele mit anderen Studien übereinstimmen.Der Vergleich von virulenzbezogenen Phänotypen zwischen biologischen Replikaten aus simulierter Mikrogravitation und Kontrollorientierungskulturen zeigte im Allgemeinen nur wenige Änderungen in der Antibiotikaempfindlichkeit, während die Säuretoleranz und -adhäsion zwischen biologischen Replikaten signifikant variierte und im Vergleich zu den angestammten Populationen abnahm.Am wichtigsten ist, dass unsere Daten die Bedeutung einer parallelen Kontrolle der normalen Schwerkraft, der Sequenzierung zu mehreren Zeitpunkten und der Verwendung biologischer Replikate für eine angemessene Analyse der Anpassung in simulierter Mikrogravitation zeigen.Da der Wunsch der NASA, Planeten wie den Mars zu erforschen und menschliche Besiedlung zu errichten, zunimmt, ist die Verhinderung und/oder Vorhersage potenzieller Bedrohungen für die Missionsziele eine Hauptpriorität.Menschen stehen im Weltraum vor vielen Herausforderungen1,2;Ein Beispiel sind die vielen mikrobiellen Herausforderungen, denen sie begegnen, die möglicherweise ihr eigenes Leistungsniveau und die Integrität ihres Raumfahrzeugs und Lebensraums beeinträchtigen3,4.Mikroben sind nicht nur auf der Erde allgegenwärtig, sondern auch leicht auf Strukturen zu finden, die von Menschen in der Raumfahrtumgebung bewohnt werden3,5.Die normale Flora der Besatzung beherbergt große Mengen an Mikroben, was sie zur wichtigsten Quelle bakterieller Kontamination macht6,7,8,9.Das menschliche Mikrobiom ist überlebenswichtig, da es beim Abbau von Nahrung hilft, uns vor Krankheitserregern schützt und sogar unser Immunsystem stärkt.Unter Stressbedingungen wird die Zusammensetzung der normalen Flora oft verändert, was letztendlich zu Dysbiose und Krankheit führt10,11,12,13,14.Diese Dysbiose könnte durch die während der Raumfahrt auftretende Immundysregulation weiter verstärkt werden15,16,17,18,19,20.Daher ist eine Infektion durch opportunistische Krankheitserreger während eines Weltraumflugs besorgniserregend21.Geringe Scherspannung und reduzierte Schwerkraft können mikrobielle Dysbiose fördern und die Bakterienphysiologie verändern4,22,23,24.Experimente haben gezeigt, dass Mikroben unter simulierter Mikrogravitation eine neuartige Resistenz entwickeln können25, ein verstärktes Wachstum26, eine Biofilmbildung27,28, eine extrazelluläre Polysaccharidproduktion29, eine erhöhte Produktion von Sekundärmetaboliten30 zeigen und gleichzeitig Veränderungen in der pathogenen Stressreaktion und Virulenz22,31,32,33 zeigen können.Um das Auftreten von Infektionen im Weltraum zu reduzieren, werden sowohl das Raumfahrzeug als auch die Besatzung vor dem Flug einem gründlichen mikrobiellen Screening unterzogen34, aber diese Minderungsstrategie kann möglicherweise nicht verhindern, dass innerhalb der Mikroflora der Besatzung neuartige evolutionäre Phänotypen entstehen, die sich aufgrund ihrer Exposition gegenüber der neuartigen Umgebung anpassen Raum.Langfristige Weltraummissionen und eine erhöhte Exposition gegenüber simulierter Schwerelosigkeit und Strahlung haben eine erhöhte Inzidenz von Munderkrankungen bei Astronauten gezeigt35.Infolgedessen weist die Space Medicine Exploration Medical Condition List darauf hin, dass Diagnose- und Behandlungsmöglichkeiten für grundlegende zahnärztliche Verfahren verfügbar gemacht werden36.Darüber hinaus sagt das Integrated Mathematical Medical Model voraus, dass zahnärztliche Notfälle eine der wichtigsten Bedingungen sein werden, die sich auf zukünftige Missionsziele auswirken37.Ungefähr 20 % der oralen Bakterien sind Streptokokken, diese Organismen sind sowohl für die frühe Entstehung von Zahnbelag als auch für Karies verantwortlich38,39.Die Phänotypen dieser Organismen, wie sie auf der Erde existieren, sind gut untersucht und Behandlungsstrategien sind besser vorhersagbar, aber diese gelten möglicherweise nicht für langfristige Weltraumreisen.Der menschliche Mund ist eine sehr komplexe Gemeinschaft, die aus über 1000 verschiedenen Arten besteht und nach dem Magen-Darm-Trakt die zweitkomplexeste ist40,41.Diese Gemeinschaften erreichen Zelldichten von bis zu 1011 CFU mL−142, obwohl sie ständig wechselnde Umweltbelastungen wie Nahrungsaufnahme, Temperatur, pH-Wert und Speichelfluss aushalten müssen43,44,45.Das orale Mikrobiom spielt nicht nur eine Rolle bei der Aufrechterhaltung der Mundgesundheit, sondern auch bei der Aufrechterhaltung der systemischen Gesundheit, da alle Oberflächen der Mundhöhle (Zähne, Zahnfleisch, Zunge usw.) von Mikroben bewohnt werden, was dazu beiträgt, die Besiedelung durch Krankheitserreger zu verhindern46,47.Trotzdem bleibt Karies eine der am weitesten verbreiteten Krankheiten beim Menschen48.Von den Bewohnern des oralen Mikrobioms wurde Streptococcus mutans aktiv auf seine kariogenen Eigenschaften hin untersucht, da dieser Organismus nicht nur Karies verursacht, sondern auch Teil der normalen menschlichen Plaque ist49.S. mutans ist ein grampositiver fakultativer Anaerobier (Firmicutes), der normalerweise als Mitglied der reifen Zahnbiofilm-Gemeinschaft existiert, aber unter bestimmten Bedingungen die dominante Spezies werden kann, die zu Zahnkaries führt50,51.Die Bildung von Zahnkaries hängt von zwei Faktoren ab, 1) einer ökologischen Verschiebung, die das Wachstum von säureproduzierenden Bakterien begünstigt, und 2) dem Vorhandensein von Saccharose in der Umgebung sowohl für die Fermentation als auch für die Produktion von Glucanen, die das Anhaften des Organismus am Zahn erleichtern , was zur Bildung des Plaque-Biofilms führt, der gegenüber niedrigem pH52 tolerant ist.Zwei Kurzzeitstudien bewerteten die Auswirkungen der simulierten Mikrogravitation auf S. mutans.Orsini et al.53 zeigten unter Verwendung eines High Aspect Ratio Vessel (HARV) für 48 Stunden, dass S. mutans sowohl transkriptomische als auch metabolomische Veränderungen im Kohlenhydratstoffwechsel und erhöhten Stress in Form von Wasserstoffperoxid-Empfindlichkeit durchmachte und Unterschiede zwischen biologischen Replikaten feststellte.Orsini et al.53 zeigten auch eine Zunahme der Zellaggregate, was auf eine Zunahme der Zell-zu-Zell-Adhäsion und/oder Biofilmbildung hinweist.Anschließend stellten Cheng et al.54 fest, dass S. mutans nur geringe Veränderungen im Wachstum und in der Wasserstoffperoxidtoleranz zeigte, während es als Reaktion auf simulierte Mikrogravitation eine Zunahme der Säuretoleranz aufwies.Der Wert dieser Kurzzeitstudien (48 h) ist schwer einzuschätzen, da ein typischer Einsatz 4–6 Monate am Stück dauern kann.Es ist sehr wahrscheinlich, dass diese Kurzzeitstudien nur eine potenzielle physiologische Akklimatisierung im Gegensatz zu einer evolutionären Anpassung darstellen55.Derzeit haben wir nur begrenztes Wissen über die mikrobielle Anpassung als Reaktion auf lange Raumflüge.Der gewöhnliche menschliche Bewohner: Streptococcus mutans, wird von jedem Astronauten ins All gebracht49.Daher sind Studien wie die vorliegende unerlässlich, um vorherzusagen, welche Organismen das Potenzial haben, sich zu Stämmen mit erhöhter Virulenz zu entwickeln und im Weltraum ein größeres Risiko für die menschliche Gesundheit darzustellen.Experimentelle Evolution gefolgt von Experimenten zur Resequenzierung des gesamten Genoms (EERseq) werden üblicherweise zur Bewertung der genomischen Veränderungen im Zusammenhang mit Selektionsregimen verwendet56,57,58,59,60,61.Tirumalai et al.62 adaptierten E. coli in simulierter Mikrogravitation für 1000 Generationen (~50 Tage) unter Verwendung von HARVs und zeigten, dass es erworbene genomische Veränderungen in Genen erwarb, die an der Proteinfaltung der äußeren Membran, dem Ionentransport und der Stressreaktion beteiligt sind.In einem ähnlichen Experiment bewerteten sie auch die Folgen einer regelmäßigen Antibiotikatherapie63.Bis heute sind dies die einzigen langfristigen mikrobiellen Anpassungsstudien in simulierter Mikrogravitation in der Literatur62,63.Leider sind Anpassungsexperimente an simulierte Mikrogravitation, wahrscheinlich aufgrund der Notwendigkeit von Spezialausrüstung, oft mit wenigen biologischen Replikaten (Populationen, die sich parallel entwickelt haben, um zufällige Variationen zu erfassen) und oft ohne Populationen mit normaler Schwerkraft zum Vergleich, zu schwach.Das Fehlen einer normalen Schwerkraftkontrolle bedeutet, dass Tirumaliai et al.62,63 nicht berechtigterweise behaupten konnten, dass die Varianten, die während ihrer simulierten Mikrogravitationsbehandlung entstanden, nicht nur Anpassungen an einen anderen Aspekt ihrer Umgebung, wie etwa das Medium, waren.In der vorliegenden Studie haben wir HARVs verwendet, um die adaptive Reaktion von vier biologischen Replikaten von S. mutans auf simulierte Mikrogravitation64 über 100 Tage (~ 1400 Generationen) zu bewerten, um die Folgen einer langfristigen Raumfahrt auf normal lebende Organismen besser zu verstehen Bewohner des Wirtsmikrobioms.Die Anpassungsreaktion wurde bewertet, indem alle drei Wochen eine Resequenzierung des gesamten Genoms durchgeführt wurde, und die mit der Virulenz korrelierten Phänotypen wurden nach 100 Tagen Anpassung bewertet.Alle angepassten Populationen wurden sowohl mit der angestammten Population als auch mit ihren Gegenstücken mit normaler Schwerkraft verglichen, die sich nur durch die Rotationsachse des Gefäßes selbst unterscheiden4,65.Das Verständnis der langfristigen Entwicklung des menschlichen Mikrobioms im Weltraum wird daher ein wichtiger Schritt sein, um die Auswirkungen der Raumfahrt auf den Menschen und seine ansässigen Mikroben besser zu verstehen.Streptococcus mutans Clarke Stamm NCTC 10449 wurde von der ATCC [https://www.atcc.org/products/25175] erworben.Alle Standardwachstumsexperimente wurden in Brain Heart Infusion (BHI)-Bouillon (oder Agar) bei 37 °C mit 5 % CO2 durchgeführt, sofern nicht anders angegeben.High Aspect Rotating Vessels (HARVs) wurden von Synthecon Inc., Houston, TX gekauft und verwendet, um S. mutans unter simulierter Mikrogravitation zu kultivieren.Vor der Inokulation wurden die HARVs mit einem milden Spülmittel und Wasser gereinigt und zweimal mit destilliertem Wasser gespült.Alle Komponenten wurden dann 15 Minuten lang in einer 25%igen Bleichlösung eingeweicht, ausgiebig mit Leitungswasser gespült und dann mit destilliertem Wasser gespült.Die HARVs wurden dann (laut Hersteller) lose wieder zusammengesetzt, in Alufolie eingewickelt und 20 min bei 121 °C autoklaviert.Die HARVs wurden dann 2 h lang abkühlen gelassen.Nach dem Abkühlen wurden die HARVs mit 5 ml BHI-Brühe beladen und bei 25 U/min für 24 h, bei 37 °C und 5 % CO2 auf die Rückplatte des Rotators gestellt, um sicherzustellen, dass die HARVs steril waren.Dieses Verfahren wurde jedes Mal wiederholt, wenn im Laufe des 100-tägigen Evolutionsexperiments eine Kontamination festgestellt wurde.Die physikalische und mechanische Entladung durch simulierte Mikrogravitation in bodengestützten Systemen wurde in vielen Studien durchgeführt und charakterisiert, wie sich simulierte Mikrogravitation auf verschiedene Organismen und biologische Systeme auswirkt4,6,15,22,23,24,25,26,27,29,53 ,54,62,66,67,68,69,70,71,72,73.Eine Übersicht über die experimentellen Methoden ist in Fig. 1 dargestellt. S. mutans Clarke-Stamm NCTC 10449 wurde verwendet, um 3 ml frische BHI-Brühe zu inokulieren und über Nacht unter Schütteln bei 250 U/min inkubiert.Diese Stammlösung wurde dann verwendet, um eine BHI-Agarplatte auszustreichen und über Nacht inkubieren zu lassen.Eine einzelne Kolonie wurde dann verwendet, um einen Glycerolvorrat herzustellen, der als Stammpopulation gilt.Anfängliche Wachstumskurven der Ahnenpopulation in den HARVs zeigten eine Sättigung nach ~24 h und die Generationszeit wurde mit ~14 pro 24 h bestimmt (eine Generation pro ~105 min).Zu Beginn des EE-Protokolls wurde der Stamm der Vorfahren verwendet, um eine weitere Übernachtkultur zu starten.100 &mgr;l dieser Übernachtkultur wurden dann zum Beimpfen von 100 ml frischer BHI-Brühe verwendet, 10 ml der Subkultur wurden dann in eine sterile 10-ml-Spritze geladen und in eine der beiden Öffnungen am HARV (Einlass) geschraubt, a zweite leere Spritze wurde auf die zweite Öffnung (Auslass) aufgesetzt.10 ml wurden dann in den Einlass gedrückt, während die Spritze am Auslass das Medium aus dem HARV sammelte.Dies wurde für alle 8 HARVs wiederholt.Vier der HARVs wurden dann auf der vertikalen Rotationsachse senkrecht zur Schwerkraft und als normale Schwerkraft inkubiert, um als Kontrollen zu dienen, und die anderen vier wurden auf der horizontalen Achse inkubiert, um simulierte Mikrogravitation zu simulieren.Alle acht HARVs wurden über Nacht bei 37 °C mit 5 % CO2 bei 25 U/min inkubiert.Nach 24 h Wachstum (~ 14 Generationen, ergänzende Abb. 3) wurden die HARVs dann subkultiviert, indem 10 ml frisches BHI in die Einlassöffnung gegeben wurden, wodurch die Kultur aus dem HARV in eine leere Spritze gedrückt wurde, die an der Auslassöffnung befestigt war, und zurückgegeben in den Inkubator für einen neuen 24-Stunden-Zyklus.Dies wurde täglich für 100 Tage (~1400 Generationen) durchgeführt.Während der EE-Studie wurden die HARVs täglich auf Kontamination überprüft, indem erstens die OD600 gemessen wurde, Werte größer als 1 zeigten oft eine Kontamination an, zweitens führten wir eine einfache Färbung mit Kristallviolett auf einem Aliquot der Kultur durch und beobachteten es unter a zusammengesetztes Lichtmikroskop für allgemeine Form und Anordnung und alles, was für S. mutans uncharakteristisch war.Dann stellten wir zweimal pro Woche Glycerinvorräte her und plattierten Reihenverdünnungen sowohl auf BHI-Agar als auch auf Mitis-Salivarius-Bacitracin-Agar (MSB), der sowohl selektiv als auch differentiell für S. mutans ist.Diese Platten wurden verwendet, um die Unversehrtheit des Glycerolvorrats zu validieren, der im Falle einer zukünftigen Kontamination verwendet werden würde.Zu jedem Meilensteinzeitpunkt (21-, 42-, 63- und 100-Tage) wurde der Rest der Kultur pelletiert und bei –80 °C für die DNA-Sequenzierung gelagert.Wenn eine Kontamination festgestellt wurde, würden wir die HARVs wie zuvor beschrieben sterilisieren, 24 Stunden lang mit frischem Medium inokulieren und dann mit der zuletzt validierten Glycerin-Stammlösung inokulieren.Schematische Darstellung des experimentellen Evolutionsablaufs, der verwendet wird, um Streptococcus mutans an die simulierte Mikrogravitation anzupassen.Alle acht 100-Tage-Populationen wurden zusätzlich zu den Vorfahren verwendet, um BHI-Platten in dreifacher Ausfertigung abzutupfen.Auf jeder dieser Platten wurde ein Etest®-Streifen (bioMériux) in die Mitte der Platte gelegt und 48 h lang inkubiert, um konfluente Rasenflächen zu erhalten.Die Empfindlichkeit gegenüber Antibiotika wurde dann gemessen, indem die minimale Konzentration auf dem Streifen bestimmt wurde, bei der Wachstum beobachtet wurde.Dieser Wert wurde dann für jede der acht entwickelten Populationen mit den Werten verglichen, die für die Vorfahrenpopulation erhalten wurden, indem eine einfache ANOVA in GraphPad Prism unter Verwendung der Mehrfachvergleichsfunktion mit den Vorfahren durchgeführt wurde.Insgesamt wurden sechs Antibiotika getestet, darunter: Amoxicillin, Penicillin, Clindamycin, Erythromycin, Methicillin und Vancomycin.Säureresistenz ist eines der wichtigsten Virulenzmerkmale von S. mutans, daher haben wir unsere weiterentwickelten Populationen auf Veränderungen in ihrer Fähigkeit, bei niedrigem pH-Wert zu überleben, untersucht.Säuretoleranztests wurden wie an anderer Stelle beschrieben durchgeführt74.Kurz gesagt, nach dem Entfernen der Kulturen aus den HARVs wurde eine Probe jeder Population entnommen und auf eine OD600 von 0,3 verdünnt.Diese Kulturen wurden dann zentrifugiert, um die Zellen zu pelletieren, und dann unter Verwendung von 0,2 M Glycin pH 6,8 gewaschen.Die Proben wurden erneut pelletiert und 0,2 M Glycin pH 2,8 für 0, 20, 30 und 45 min ausgesetzt.Am Ende der Inkubationszeit wurden die Proben pelletiert und in 0,2 M Glycin pH 6,8 resuspendiert.Reihenverdünnungen jedes Zeitpunkts wurden dann auf BHI-Agar ausplattiert und die CFUs wurden nach 24 h Inkubation gezählt und mit den CFU-Zählungen der Vorfahrenpopulation verglichen.Jede Verdünnung wurde dreifach ausplattiert, um genaue CFU-Zählungen zu erhalten.Die Fähigkeit, am Zahnhäutchen zu haften, ist ein weiterer wichtiger Virulenzfaktor, den S. mutans benötigt, um sich in einem Biofilm zu etablieren.Daher wurden nach 100 Tagen alle acht subkultivierten Populationen auf Veränderungen ihrer Adhäsionsfähigkeiten untersucht.Die Kulturen wurden zuerst auf eine OD600 von 0,05 verdünnt und 5 μl wurden verwendet, um 95 μl frische BHI-Brühe, ergänzt mit 0,1 % Saccharose, um die Saccharose-abhängige Adhäsion zu messen, oder 0,1 % Glucose, um die Saccharose-unabhängige Adhäsion zu messen, in einer Platte mit 96 Vertiefungen zu inokulieren dreifach.Die Platten wurden dann ohne Schütteln bei 37 °C für 24 und 48 h mit 5 % CO2 inkubiert.Nach 24 h wurde das Medium entfernt und die Platte mit destilliertem Wasser gewaschen.200 &mgr;l einer 1%igen Kristallviolettlösung wurden dann zu der gewaschenen Platte gegeben und für 2 h inkubieren gelassen.Die Platten wurden dann dreimal mit Wasser gewaschen und über Nacht trocknen gelassen.Am folgenden Tag wurden 200 &mgr;l Essigsäure verwendet, um das Kristallviolett von anhaftenden Zellen zu lösen, und dann wurde bei 595 nm abgelesen.Jede Population wurde in drei separate Vertiefungen plattiert, um drei unabhängige Messungen für jede Population zu erhalten.Chromosomale DNA wurde aus den Pellets extrahiert, die aus den 21-, 42–63- und 100-Tage-Proben für alle acht evolvierten Populationen und die Vorfahren stammten, unter Verwendung des EZNA-Bakterien-DNA-Extraktionskits von Omega Biotek® gemäß dem Protokoll des Herstellers.Eluierte DNA wurde dann unter Verwendung des QuantiFluor ® dsDNA-Systems (Promega) quantifiziert.300 ng gereinigte genomische DNA wurden verwendet, um DNA-Bibliotheken unter Verwendung des Nextera XT DNA Library Prep Kit (Illumina) herzustellen.Die Proben wurden dann auf einer Illumina miSEQ-Sequenzierungsplattform mit einer Abdeckungstiefe von etwa 100-fach bis etwa 200-fach sequenziert, wobei die Abdeckung meist über 150-fach lag.Sequenzabgleich und Varianten-Calling aus den Proben wurden durch die Verwendung der breseq 0.30.0-Pipeline75 erreicht.Die Breseq-Pipeline verwendet drei Arten von Beweisen, um Mutationen vorherzusagen, Read Alignments (RA), Missing Coverage (MC) und New Junctions (JC) sowie alle Reads, die auf einen Unterschied zwischen der Probe und dem Referenzgenom hinweisen, der nicht aufgelöst werden kann genaue genetische Veränderungen beschreiben, werden als „nicht zugeordnet“ aufgeführt.Diese nicht zugewiesenen Lesevorgänge werden hier weder beschrieben noch interpretiert.Alle phänotypischen Daten wurden in GraphPad Prism ® Version 9.2.0 aufgetragen.Statistiken für paarweise Vergleiche zwischen Vorfahrenpopulationen und jeder individuellen Behandlungspopulation wurden unter Verwendung eines ungepaarten T-Tests berechnet.Die Signifikanz wird durch den zweiseitigen p-Wert mit einem * definiert.* ≤ 0,05, ** ≤ 0,01, *** ≤ 0,001 und **** ≤ 0,0001.Lineare Regression wurde verwendet, um die Anzahl der akkumulierten Mutationen für jede normale Gravitationspopulation und jede simulierte Mikrogravitationspopulation zu vergleichen.Eine allgemeine lineare Analyse in SPSS wurde verwendet, um die Populationen mit normaler Schwerkraft und simulierter Mikrogravitation zu vergleichen.Schließlich wurde eine Chi-Quadrat-Analyse mit SPSS verwendet, um die genomischen Varianten zu vergleichen, um die Auswirkung der Umgebung auf die Selektion zu bestimmen, und eine einfache lineare Regression wurde in GraphPad Prism mit einem Konfidenzintervall von 95 % durchgeführt, um die Signifikanz in der Steigung für die Berichterstattung über die Akkumulation zu bestimmen Mutationen sowohl in normaler Schwerkraft als auch in simulierter Mikrogravitation.Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.Nach der 100-tägigen EE-Studie bewerteten wir die genetischen Veränderungen, die als Reaktion sowohl auf die normale Schwerkraft als auch auf die simulierte Mikrogravitationsanpassung durch DNA-Resequenzierung des gesamten Genoms zu mehreren Zeitpunkten (21- (~ 294 Generationen), 42- (~ 588 Generationen) auftraten. , 63- (~882 Generationen) und 100 Tage (~1400 Generationen)).Das in dieser Studie verwendete S. mutans NCTC 10449-Genom (Smutans_NCTC10449.gbk [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NZ_LS483349.1]) ist schlecht annotiert und charakterisiert, daher basieren viele Genfunktionen darauf diejenigen mit hoher Sequenzhomologie zu S. mutans UA159-Genen (SMU-annotierte Gene)76.Ausrichtung und Varianten-Calling wurden mit breseq 33.275 durchgeführt.Coverage-Verteilungsplots von kartierten Reads, die von Breseq ausgegeben wurden, zeigten eine Coverage-Tiefe für einzigartige Positionen, die von ~150x bis über 200x reichte, wobei die meisten eine ~200x-Coverage zeigten.Dies übersteigt bei weitem die Mindestabdeckung für echtes Varianten-Calling von ~50x für geführte Referenzmontage77.Alle Sequenzierungsdaten mit Mutationshäufigkeiten (f) über 0,1 sind in der Ergänzungstabelle 1 zusammengefasst. Die in dieser Studie generierten und analysierten Datensätze sind in der NCBI BioProject-Datenbank unter der Bioprojektnummer PRJNA759625, Zugangsnummern SAMN23239391-SAMN23239423 [https:// www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/?term=PRJNA759625].Wir begannen mit der Sequenzierung der Ahnenpopulation (NCTC 10449 [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NZ_LS483349.1]) und identifizierten drei Variationen beim Vergleich mit der Sequenz der Referenzdatenbank, dazu gehört ein SNP ( I365S (ATT → AGT)) in DQM59_RS03765, einer UDP-N-Acetylglucosamin-2-Epimerase, und eine Insertion sowohl in DQM59_RS03875, einem Membranprotein der TIGR01906-Familie, als auch in der intergenischen Region zwischen trxB ←/← DQM59_RS08210, einer Thioredoxin-Disulfid-Reduktase und a Protein der DUF4059-Familie.Daher sind diese Sweeps (f = 1.000) nicht das Ergebnis unserer Anpassungsstudien (Ergänzungstabelle 1, gelb hervorgehoben).Im Laufe des 100-tägigen Experiments traten Varianten auf, die sowohl bei den normalen als auch bei den simulierten Mikrogravitationsbehandlungen auftraten (Ergänzungstabelle 1 – orange).Am Tag 21 gab es fünf Varianten, die in der intergenischen Region zwischen einem AAA-Domänen-enthaltenden Protein und einer Dihydrolipoyl-Dehydrogenase erschienen.Diese wurden bei jeder Behandlung in mindestens einer Wiederholung nachgewiesen, alle mit ähnlichen Häufigkeiten.Am Tag 42 gab es 3 gemeinsame Varianten, zwei davon in derselben intergenischen Region oben, und eine neue gemeinsame Variante, die in einer C3-Glykoprotein abbauenden Protease (C3-GDP) auftauchte, für die ursprünglich in der simulierten Mikrogravitation selektiert worden war Populationen am Tag 21 (Tabelle 1).Bemerkenswerterweise erschien die einzelne Normalgravitationsvariante mit sehr geringer Häufigkeit (0,089), während sie in zwei simulierten Mikrogravitationspopulationen (0,580 und 0,882) mit hoher Häufigkeit auftrat;was darauf hindeutet, dass diese Variante eine Rolle bei der simulierten Mikrogravitationsanpassung gespielt haben könnte.Am Tag 63 gab es wieder drei gemeinsame Varianten, nur eine der intergenischen Varianten blieb übrig, die C3-GDP-Variante hatte (f = 1,000) in einer Wiederholung der simulierten Mikrogravitation gefegt, während sie in normaler Schwerkraft bei niedriger Frequenz (0,087) blieb.Auch dies unterstützt eine adaptive Rolle für diese Variante in der simulierten Mikrogravitation.Es gab auch eine neue gemeinsame Variante in DQM59_RS07180, ptsH (Phosphocarrier Protein HPr), die mit niedriger Frequenz in zwei normalen Gravitationsreplikaten und mit hoher Frequenz (mit einem Sweep f = 1.000) in der simulierten Mikrogravitation beobachtet wurde (Tabelle 1).Schließlich gab es an Tag 100 sechs geteilte Varianten.Eine in derselben intergenischen Region zwischen einer AAA-Domäne, die ein Protein und eine Dihydrolipoyldehydrogenase enthält, eine in ptsH, die das Muster von Tag 63 wiederholt, zwei in C3-GDP mit selektiven Sweeps sowohl bei normaler Schwerkraft als auch bei simulierter Mikrogravitation (Tabelle 1), und zwei neue Varianten DQM_RS03695 (hypothetisches Protein) und DQM_RSO7235 (N-Acetyl-Gamma-Glutamyl-Phosphat-Reduktase) bei mittleren Frequenzen.Die Sequenzierungsdaten zeigten auch adaptive Varianten, die nur für Populationen mit normaler Schwerkraft gelten (Ergänzungstabelle 1 – blau).Am Tag 21 gab es 3 einzigartige nicht-synonyme (NS) SNP-Varianten im Bereich von f = 0,076–0,265 in allen vier Populationen mit normaler Schwerkraft in zwei Genen.An Tag 42 gab es 22 einzigartige Polymorphismen (f = 0,051–0,744), davon waren 16 NS-SNPs, 3 synonyme (S)-SNPs und der Rest befand sich in den intergenischen/kodierenden Regionen.An Tag 63 gab es 58 einzigartige Varianten (f = 0,051–0,711), 35 waren NS-SNPs, 14 S-SNPs und 9 waren intergenisch/codierend.Schließlich gab es am Tag 100 45 einzigartige Polymorphismen, von denen 32 NS-SNPs waren, 2 S-SNPs waren und 11 intergenisch/codierend waren.Von diesen 45 wurden drei Gene von mehreren Populationen gemeinsam genutzt und hatten Varianten, die nur bei normaler Schwerkraft vorhanden waren (Tabellen 2 und 3).Dazu gehören Varianten in einem Protein, das die DUF1003-Domäne enthält (NG1-E195G und R199C, NG2-R181C und S231R, NG3-Q100* und R140*) und die Hydrolase der Cof-Typ-HAD-IIB-Familie (NG3-E244* und NG4 -G54A) und sprV (NG1-K15N und NG3-F52V).Darüber hinaus wurden viele einzigartige Varianten in einer einzigen Population mit normaler Schwerkraft entdeckt (Tabelle 3).Die einzige, die früh erworben und von einem Sequenzierungszeitpunkt zum nächsten beibehalten wurde, war die Q31*-Mutation in einem Protein der RidA-Familie in NG4.Diese Variante trat zuerst in zwei Populationen (NG3; f = 0,381 und NG4; f = 0,138) am Tag 42 auf und wurde nur in NG4 (f = 0,547) nach 100 Tagen aufrechterhalten, was darauf hinweist, dass diese Populationen wahrscheinlich von Klonen übertroffen wurden, die die Wild- Typ Gensequenz.NG2 erwarb 3 hochfrequente Mutationen, darunter ein Sweep in der intergenischen Region zwischen acnA und nrdH (f = 1,000), eine 30-bp-Deletion in der codierenden Region des PTS-Zuckertransporters, Untereinheit IIB (f = 0,619) und eine P169L-Mutation in trkA (f = 0,925).NG3 erwarb zwei Mutationen mit mittlerer Häufigkeit, eine F98V-Mutation in einem CBS-Domänen-enthaltenden Protein (f = 0,527) und eine P239S-Mutation in einer Hydrolase der HAD-Familie (f = 0,331).Schließlich erwarb NG4 zehn Mutationen in neun verschiedenen Genen, drei der Varianten zeigten eine mittlere Häufigkeit, einschließlich derjenigen, die im Protein der RidA-Familie nachgewiesen wurden, einer intergenischen Mutation zwischen einer NAD(P)H-abhängigen Oxidoreduktase und einer Thiaminpyrophosphat-abhängigen Dehydrogenase (f = 0,333) und zwei separate Varianten in lytS (S191* f = 0,181 und Q229* f = 0,150).Die Sequenzierungsergebnisse zeigten, dass es mehrere Varianten gab, die für die simulierten Mikrogravitationspopulationen einzigartig waren (Ergänzungstabelle 1 – grün).Am Tag 21 gab es 8 einzigartige Varianten im Bereich von f = 0,063–0,333 in den vier simulierten Mikrogravitationspopulationen, von denen 3 NS-SNPs und 5 intergenisch/kodierend waren.An Tag 42 gab es 17 einzigartige Polymorphismen (f = 0,053–0,575), 14 waren NS-SNPs, 1 ein S-SNP und zwei in den intergenischen/codierenden Regionen.An Tag 63 gab es 14 einzigartige Varianten (f = 0,052–1,000), 11 waren NS-SNPs und 3 waren intergenisch/codierend.Schließlich gab es an Tag 100 30 einzigartige Polymorphismen (f = 0,059–0,929), 24 waren NS-SNPs und 6 waren intergenisch/codierend.Nach 21 Tagen war die signifikanteste Variante eine Insertion in das Pseudogen DQM59_RS099330, die in MG1 auftrat.Darüber hinaus wurden fünf verschiedene Varianten im C3-GDP für alle vier simulierten Mikrogravitationspopulationen nachgewiesen (normale Schwerkraftpopulationen erwarben bis zum 42. Tag keine Mutationen in diesem Gen, Tabelle 1).Am Tag 42 hatte jede der simulierten Mikrogravitationspopulationen mindestens eine Variante, die mit einer Häufigkeit > 0,470 aufgetreten war.Diese traten in vier verschiedenen Genen auf: dem Redox-Sensing-Transkriptionsregulator rex, dem Phosphocarrier-Protein ptsH, dem C3-GDP und einer intergenischen Mutation zwischen einem AAA-Domänen-enthaltenden Protein und Dihydrolipoyldehydrogenase (Tabelle 1 und Ergänzungstabelle 1).An Tag 63 wurden vier eindeutige Mutationen mit einer Häufigkeit von > 0,520 in den vier Wiederholungen nachgewiesen.Diese umfassen: DQM59_RS01220 (Protein der DUF1033-Familie), rex, pknB (Ser/Thr-Kinase der PASTA-Domäne der Stk1-Familie) und C3-GDP (Tabellen 1 und 2).Schließlich wurden am Tag 100 12 einzigartige Varianten in den vier Wiederholungspopulationen nachgewiesen (zehn mit Frequenzen > 0,400).Neun dieser Varianten waren NS-SNPs und 3 waren intergenisch oder innerhalb eines Pseudogens.Nach 100 Tagen gab es drei Gene, die Mutationen in mehreren Populationen erwarben und Varianten trugen, die für die simulierte Mikrogravitationsumgebung einzigartig waren;dazu gehören das die DUF1003-Domäne enthaltende Protein (MG1-K102Q und T235R, MG3-A166S und A166D und MG4-A157V), pknB (MG1-IS2, MG4-R258C und G19A) und C3-GDP (MG1-S112Y und E58*, MG2-E221* und MG4–14bp und eine 6-bp-Insertion der codierenden Region) (Tabellen 1 und 2).Diese sind zusätzlich zu den einzelnen Varianten in jeder Population bei 100 Tagen (Tabelle 4).Hier adaptierte MG1 zwei hochfrequente Mutationen, eine intergenische Mutation in der Polymerase-Untereinheit delta (f = 0,836) und eine G88A-Mutation (f = 0,877) in rpoC, zusätzlich zu drei niederfrequenten Mutationen, eine im Membranprotein DQM59_RS00535 (G77R f = 0,199), eine in der ABC-Transporter-Permease vex3 (M267L f = 0,130) und eine in der Glutathion-Disulfid-Reduktase gorA (E251* f = 0,114).MG2 hatte eine niedrige Frequenz (f = 0,154) W443*-Mutation in vicK.MG3 trug vier einzigartige Niederfrequenzvarianten mit f = 0,150 in trkB (V96G), zwei in lepA (D80A und L81F) und eine 114-bp-Deletion in der codierenden Region von spaP.Darüber hinaus hatte MG3 drei Zwischenfrequenzvarianten, f = 0,315 in einem Pseudogen, eine Y88C-Mutation (f = 0,370) in sprV und eine Y55D-Mutation (f = 0,582) in rex.MG4 hatte nur eine einzigartige Mutation mit niedriger Frequenz (f = 0,141) in der intergenischen Region von asnS und ein hypothetisches Protein.Die Pathogenität von Streptococcus hängt von der Fähigkeit ab, an der Zahnoberfläche zu haften und Biofilme zu bilden, die allgemein als Plaque bekannt sind.Sie tun dies, indem sie Aggregate bilden, die über zwei unabhängige Mechanismen mit dem Zahnhäutchen verschmelzen: Saccharose-abhängige und Saccharose-unabhängige Adhäsion.Ersteres ist für die anfängliche Adhärenz angemessen, letzteres ist jedoch für Virulenz und Pathogenität erforderlich52.Wir haben daher sowohl die Saccharose-abhängige (SDA) als auch die Saccharose-unabhängige Adhäsion (SIA) für die vier 100-Tage-angepassten Normalgravitationspopulationen (NG1–4) und die vier 100-Tage-simulierten Mikrogravitations-angepassten Populationen (MG1–4) analysiert und paarweise durchgeführt Vergleiche mit den Phänotypen der angestammten Population (Abb. 2).Die SDA wurde durch Inokulieren von 96-Well-Platten, die BHI-Medium, ergänzt mit 0,1 % Saccharose, enthielten, mit Kulturen von den HARVs, die auf eine anfängliche OD600 von 0,05 verdünnt waren, bewertet und ohne Schütteln für 24 und 48 h inkubiert.Vergleiche mit der angestammten Population zeigen eine Abnahme der SDA in zwei der Populationen mit normaler Schwerkraft (NG2 und NG3) und eine kleine Abnahme in drei der Populationen mit simulierter Mikrogravitation (MG2–4), wenn sie 24 Stunden lang gewachsen sind (Abb. 2a).Bis 48 h hatten alle Populationen ähnliche Adhäsionswerte (NG2, MG1–4) oder höher (NG1 und NG4) wie die der Vorfahren wiederhergestellt, mit Ausnahme von NG3, das auch nach 48 h weiterhin ein signifikantes Defizit an SDA zeigte (Abb 2b).Saccharose-abhängig (SDA) wurde nach (a) 24- und (b) 48-stündigem statischem Wachstum in BHI, ergänzt mit 0,1 % Saccharose, unter Verwendung der 100-Tage-Populationen bewertet.Saccharose-unabhängige Adhäsion (SIA) wurde nach (c) 24- und (d) 48-stündigem statischem Wachstum in BHI, ergänzt mit 0,1 % Glucose, unter Verwendung der 100-Tage-Populationen bewertet.Die Daten wurden in GraphPad Prism ® 9.2.0 aufgetragen und ungepaarte t-Tests mit 95 % Konfidenz wurden verwendet, um signifikante Unterschiede für paarweise Vergleiche zwischen den Vorfahren- und jeder Behandlungspopulation zu berechnen.Fehlerbalken sind sem und die Signifikanz wird als zweiseitiger p-Wert angegeben, wobei *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001 und ****p ≤ 0,0001.Die Unterschiede im SIA waren dramatischer (Abb. 2c, d).Hier wurden Platten mit 96 Vertiefungen mit BHI-Ergänzung mit 0,1 % Glukose gefüllt.BHI-Brühe enthält eine geringe Glucosekonzentration (2 g L-1) und daher sind die +0,1 % zusätzlich zu den bereits im Medium vorhandenen vorhanden.Nach 24 h in +0,1 % Glukose beobachteten wir eine signifikante Abnahme der SIA für NG1–3, MG1, MG2 und MG4.Nach 48 h wiesen NG1, NG2, MG2 und MG4 einen vollständigen Verlust von SIA auf, während NG3 und MG1 ähnliche Spiegel aufwiesen wie die, die nach 24 h beobachtet wurden.MG3 zeigte nach 48 h eine kleine Abnahme gegenüber dem der Vorfahren, und NG4 zeigte nach 48 h einen signifikanten Anstieg der SIA.Abgesehen von NG4 und MG3 geht SIA in beiden Umgebungen fast vollständig verloren.Schwerkraft.Mikrobiol.Mol.biol.Ecol.Infizieren.Dis.J. Allergy Clinic.Immunol.Pr.Int.AuflösungMikrobiol.Nat.Rev. Genet.Chem.J. Clin.Investieren.Verhalten des GehirnsImmun.biol.Int.J.Mol.Vorderseite.Immunol.Infizieren.Immun.Proz.Wissenschaft.Technol.Lette.Appl.Umgebung.Mikrobiol.Med.Mikrobiol.Appl.Umgebung.Mikrobiol.Umgebung.Mikrobiol.Umgebung.Wissenschaft.Delle.J. Infizieren.Dis.Infizieren.Immun.AuflösungJ. Clin.Mikrobiol.Oral.Mikrobiol.Immunol.EUR.J. Clin.Mikrobiol.Infizieren.Dis.Lette.Genom-Biol.Proz.biol.Wissenschaft.Ecol.Vorderseite.Appl.Mikrobiol.Biotechnologie.Chem.Rec.Appl.Umgebung.Mikrobiol.Appl.Mikrobiol.Biotechnologie.Technol.Proz.Wissenschaft.Vorderseite.Mol.Oral.Mol.Oral.J.Mol.biol.Wang, Y. et al.Erw.Int.Lette.biol.Appl.Umgebung.Mikrobiol.(2011).Lette.J. Umgebung.Wissenschaft.Int.Jeder, mit dem Sie den folgenden Link teilen, kann diesen Inhalt lesen:Leider ist für diesen Artikel derzeit kein teilbarer Link verfügbar.Bereitgestellt von der Content-Sharing-Initiative Springer Nature SharedIt